Целта на методите за молекулярно генетично изследване е да се определи наличието на модификации и промени в някои хромозоми, ДНК области или гени. Този метод на работа с ДНК е широко използван на практика през 70-те и 80-те години. миналия век.
Кога се правят молекулярно-генетични изследвания
Молекулярно-генетичните изследвания помагат за диагностициране:
- Моногенни генетични заболявания;
- Вероятност за развитие на онкологични заболявания;
- Наличието на фактори, провокиращи мултифакторни заболявания.
Открива се рискът от развитие на онкологични процеси чрез използване на молекулярно-генетични изследвания:
- Рискът от развитие на рак на стомаха и щитовидната жлеза;
- Вероятността от рак на дебелото черво и ранните етапи на това заболяване;
- Генетична предразположеност към развитие на рак на тялото на матката, яйчниците, млечните и простатните жлези;
- Наличието на рекомбинация на гените ABL / BCR, открити при левкемия;
- Наличие на предпоставки, осигуряващи ефективността на антитуморна терапия с гефатиниб в присъствието на недребноклетъчен рак \ t .
Провеждането на молекулярно-генетични тестове за наличие на генетично определени предпоставки за развитие на мултифакторни заболявания, позволява да се установи рискът от развитие:
- хипертонична болест;
- прееклампсия;
- ревматоиден артрит;
- остеопороза;
- нарушения на липидния метаболизъм;
- захарен диабет тип 1 и 2;
- заболявания на репродуктивната система.
Използвайки този метод се оценява метаболизма и валидността на употребата на някои лекарства..
Кой е предписан молекулярно-генетични изследвания
Молекулярни генетични тестове се показват на индивиди:
- страдащи от безплодие;
- изложени на неблагоприятни фактори на околната среда;
- имат близки роднини в семейството, страдащи от онкологични, умствени, съдови и ендокринни заболявания.
Как е молекулярно-генетичният тест
Първият етап на молекулярно-генетичния анализ е много важен и се състои в получаване на проби от РНК и ДНК, които са отделни фрагменти от ДНК на клетката или цялата й верига. За изолиране на необходимия брой фрагменти се използва метод на амплификация, т.е. тяхното размножаване чрез полимеразна верижна реакция (ензимна репликация)..
Анализът на ДНК молекулите изисква тяхното предварително разделяне на части и лечение с бактериални ендонуклеази (рестрикти) - ензими, които могат да режат двойната спирала на ДНК в 4-6 двойки..
ДНК фрагменти са разделени по дължина и размер с помощта на специален гел (полиакриламид и агароза), използвайки електрофореза. Под действието на последния те се придвижват надолу по гела с различни скорости, оставяйки зад тях отделна лента..
Молекулярно-генетичните изследвания на наследствените патологии също се използват за изследване на човешкия геном. Southern blot хибридизация прави възможно в този случай да се определят специфичните ДНК фрагменти, необходими за това. В същото време, те първо прибягват до денатурация на ДНК, в резултат на което фрагментите се получават във формата на една верига и се прехвърлят във филтър (найлон или нитроцелулоза), който се накисва в буферен разтвор..
Гелът, върху който се намират ДНК фрагменти, се прехвърля върху филтърна хартия с физиологичен разтвор (с висока концентрация%). Нитроцелулозен филтър и филтрираща, но суха хартия (за абсорбиране на физиологичен разтвор) се поставят отгоре на свой ред. В резултат, едноверижната ДНК остава на филтъра в същото положение като на гела..
За идентифициране на необходимите фрагменти се провежда процедурата на хибридизация на ДНК с неговия клониран фрагмент или радиоактивна ДНК проба. Резултатът от тази процедура се открива чрез радиоавтография, поради което всички допълнителни проби на ДНК последователността се отразяват във формата на радиоактивна лента..
Южният метод позволява да се пресъздаде ограничителната карта на човешкия геном в определена част от гена. Това дава възможност да се открие наличието на дефекти в самия ген. Разработените методи се считат за доста ефективни и позволяват най-точната диагноза на наследствените заболявания. За тази цел ДНК се извлича от ембрионалните клетки, които се съдържат в околоплодната течност. Впоследствие, той се хибридизира, използвайки Southern blot с радиоактивна ДНК проба. В резултат на това е много лесно да се разпознае абнормен ем-йон, тъй като неговата ДНК хибридизира изключително с ДНК проба, която е комплементарна на мутантната последователност..
Съвременната наука използва редица методи за идентифициране на мутации. Всички те са разделени на косвени и директни молекулярно-генетични методи за изследване..
Използват се непреки методи за откриване на мутации, ако позицията на ген върху генетична карта е известна, но нейната нуклеотидна последователност не е дешифрирана..
Директната диагноза може да бъде от няколко вида:
- секвениране. Това е техника за идентифициране на нуклеотидната последователност, за да се определи замяната на базите в конкретен фрагмент..
- Блот хибридизация, но южна. Това е ограничителен анализ, с помощта на който откриват мутации, които имат нарушения на мястото на рестимулиране..
- Анелоспецифична хибридизация със синтетична сонда. Този метод също позволява да се открият мутации в геномната ДНК..
- Електрофореза на двойноверижна ДНК в гел (равномерно денатурираща, неутрална). Това е разцепване на ДНК на химическо и ензимно ниво. В местата, където основите са неправилно зашити, обикновено се определя група от мутации..
- Изследване на електрофоретичната мобилност на ДНК мутантни молекули.
- Анализ на синтезирания протеин чрез електрофореза. Наличието на мутации се оценява от промяната в подвижността на протеините в in vitro системата.
Мутациите също се диагностицират, като се използва дефиницията на полиморфни фрагменти (рестрикционна дължина) в генома. За тази цел се използва същата техника на Southern blot хибридизация..
Сред другите типове ДНК полиморфизъм се различават и микросателитите. Те са къси последователности на ДНК (тандемно повтарящи се моно-, ди-, три- и тетрануклеотиди). Те служат като маркери на дефектни мутации или маркери на алелни варианти на ген в изследването..
Генът, който е отговорен за развитието на хорея на Хънтингтън, тежка патология, е открит през 1993 г. С това заболяване се наблюдава намаляване на интелектуалното развитие, нарушение на движенията на ЦНС при хора след 40 години. Заболяването е наследствено и се предава от автозомно-доминантния тип, има 100% пенетрантност. Генът на заболяването се намира в 4-та хромозома, в късата ръка.
Този ген включва нуклеотидната последователност под формата на многократни повторения на CAG нуклеотида. При здрави хора такива повторения обикновено са 11-34, пациентите с хорея имат 37-86, но обикновено 45. От това следва, че хорея на Хънтингтън е наследствена патология с генна мутация при многократно увеличение на броя на копията му (експанзия).
Юлия Викторова, акушер-гинеколог