Преимплантационна диагноза (PGD) диагностика на наследствени заболявания и ембриони / reproductology

Генетичното изследване е метод, използван за диагностициране на наследствени дефекти в ембриони, получени чрез ин витро оплождане преди бременност. Предимплантационната диагноза (PGD) е алтернатива на амниоцентезата и биопсията на хорионната вълна, която често е последвана от трудно решение за аборт, ако резултатите са неблагоприятни. Днес PGD е единственият възможен вариант за избягване на висок риск от раждане на дете с генетични заболявания..

В какви случаи се извършва PGD при генетични патологии

Показания за пред-имплантационна диагностика по генетика:
Носител на автозомно-рецесивни заболявания;
Патология, свързана с Х хромозомата;
Двойки със значителни хромозомни транслокации, които пречат на имплантацията, провокират спонтанни аборти или предполагат психически или физически проблеми в потомството;
Носител на автозомно доминантни заболявания.

Диагнозата преди имплантация се използва за свързани с пола патологии, дефекти на един ген и хромозомни нарушения..

Злоупотреби, свързани с пола

Х-свързаните заболявания се предават на детето чрез майката, която е носител. Патологичната Х-хромозома причинява заболяване при синовете, които не наследяват нормалната Х-хромозома от баща си, но получават Y-хромозомата. В бъдеще се очаква раждането на здрави момчета, но вероятността за превоз на дъщери е 50%, при условие че здравето на майката е здравословно..

Важно е

Заболяванията, свързани с Х-хромозомата, никога не се предават от баща на син.

Автозомно-рецесивната патология включва хемофилия, повечето невромускулни дистрофии и стотици други заболявания..

Автозомно-доминантните нарушения ще се проявят като синдром на Rett, псевдо-хиперпаратироидизъм, рахит, устойчив на витамин D, синдром на Bloch-Sulzbergera (наследствено нарушение на кожната пигментация с патология на зрителния апарат, зъбите и централната нервна система) и др..

U-хромозомата носи малък брой гени, но някои патологии на сексуалната диференциация са свързани с нея..

При тежки форми на нарушена сперматогенеза (критично малък брой или пълно отсъствие на мъжки зародишни клетки) в 18% от случаите микроделециите се диагностицират в гена на азооспермия фактор, разположен на дългата ръка на U хромозомата.

Дефекти на единичен ген

PGD се използва за идентифициране на отделни генни дефекти, които причиняват редица заболявания:

Кистозна фиброза;
Болест на Thai Sachs;
Сърповидно-клетъчна анемия;
Болест на Хънтингтън.

С тези патологии генетичната диагноза открива дефект, използвайки молекулярни методи, използвайки амплификация на полимеразна верижна реакция (PCR) (множествена репликация) на ДНК от една клетка..

Хромозомни нарушения

Транслокацията, инверсията и делецията водят до увреждане на хромозомата, която може да бъде открита с помощта на флуоресцентна хибридизация. При някои двойки шансовете за жизнена бременност без PGD са незначителни, тъй като предишните опити са довели до появата на ембриони с хромозомна мутация и са завършили със спонтанни аборти..

Генетичен скрининг преди имплантация: относителни показания

Според проучванията, повечето ранни аборти на бременността се дължат на анеуплоидията, нарушение на броя на хромозомите. Тъй като здравите ембриони се прехвърлят в матката, вероятността от спонтанен аборт в първия и втория триместър намалява.

Понастоящем няма конкретен списък с индикации за PGD.

Предварително имплантираният генетичен скрининг се счита за желателен в следните случаи:

Планирана бременност при по-възрастна жена.
Обременена акушерска и гинекологична история с повтарящи се спонтанни аборти.
Неуспешни многократни опити на IVF, включително метода ICSI.
Тежък фактор за мъжко безплодие.

Доказаният факт, че рискът от анеуплоидия се увеличава с възрастта. По-малко вероятно е хромозомите да се разделят правилно, което води до допълнителна или липсваща хромозома в ембриона. Патологичният брой на хромозомите е повече от 20% за майките на възраст 35-39 години, а на възраст 40 години и по-възрастни достига 40%.

Честотата на анеуплоидията при деца, родени от майки на възраст 35-39 години - 0.6-1.4%, над 39 години - 1.6-10%.

Важно е

Не всички бременности завършват с раждането на жизнеспособно дете, понякога се случва самопрекъсване, преди жената да е подозрителна към състоянието си..

Пример за честа анеуплоидия е тризомия 21 на хромозомата, която води до синдром на Даун. Честотата на тризомия 21 в жизнеспособен плод се оценява в зависимост от възрастта на майката. Според резултатите оптималната възраст за раждане е от 20 до 24 години (най-ниският риск е 1/1400). На възраст 40 - 1/100, над 45 години - 1/25.

Повтарящи се аборти и PGD диагноза

Ако жената има 2 или повече последователни прекъсвания на бременността до 20 седмици, PGD се оправдава преди IVF. Причината често е неизвестна, но хромозомните аномалии в абортираните ембриони се диагностицират при 50-80%.

Обърнете внимание

Проучванията показват, че двойките с множество аборти са обект на по-висок процент анеуплоидни ембриони..

Неуспешно IVF няколко пъти подред

Три или повече неуспешни опити с IVF, включващи ембриони с високо качество, могат да покажат хромозомни аномалии. Освен това си струва да си припомним имунологичните и маточните фактори, които допринасят за нарушената имплантация..

Фактор за мъжкото безплодие

Мъжкият хипогонадизъм води до образуването на ембриони с хромозомни аномалии. При нормалната сперма има около 3–8% от заболелите сперматозоиди. Техният брой значително нараства при мъже с тежка безплодие (намаляване на количеството, лоша морфология и нарушена двигателна активност) до 27–74%.

Използвайки интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоиди в яйцеклетката, лошото качество на сперматозоидите вече не е пречка за зачеването на биологично естествено дете. Установено е, че различни генетични дефекти са свързани с мъжкия фактор на безплодието. По-често те включват анеуплоидия, синдром на Klinefelter, Y хромозомен микроделемент, андрогенни рецепторни увреждания и други автозомни генни мутации (кистозна фиброза)..

Важно е

По време на процедурата ICSI естественият отбор се изключва, така че рискът от предаване на генетични мутации на потомството се увеличава.

Избор на пол

PGD може да определи пола на ембриона, но желанието за раждане на момче или момиче без доказателства (генетични заболявания, свързани със секса) не е етично.

Съответствие с човешки левкоцитен антиген (HLA)

Сред новите индикации за PGD е сравнението на HLA. Този метод може да се използва за изключване на генетична патология. В случаите, когато семейството вече има дете с рецесивно заболяване и е необходимо лечение със стволови клетки или трансплантация на костен мозък (таласемия, левкемия), Възможно е да се избере "подходящ" ембрион, който след раждането ще стане донор за пробанда (брат или сестра). Първият случай е описан от примера на семейство с дете, страдащо от анемия на Fanconi, и PGD е извършен, за да се избере здрав ембрион със същия тип HLA като болния брат.. Използването на PGD в такива ситуации е спорно от морални и етични причини..

Предимплантационна диагноза: как се прави и какви са начините

Двойките в рисковата зона се консултират от генетик, който оценява риска от предаване на генетична патология. Провеждане на тестове, които потвърждават диагнозата на един от родителите. В зависимост от генетичното заболяване се избира диагностичен метод, с който е възможно да се идентифицират промените в ембриона..

За да се получи биоматериал за PGD, се използва само IVF.. На третия или петия ден след оплождането се извлича необходимия биоматериал. Генетичен анализ преди трансплантация се извършва с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR), флуоресцентна хибридизация (FISH), сравнителна геномна хибридизация (CGH) и NGS тестване..

Здравите ембриони се прехвърлят в матката (по правило не повече от 2), докато останалите са стъклокерамични. Бързото замразяване ви позволява да ги използвате в следните IVF цикли.

PCR

PCR се използва за диагностициране на единични генни дефекти, включително доминантни и рецесивни разстройства.. PCR (понякога наричана ДНК амплификация) е метод, при който определена последователност се копира много пъти, което позволява анализ.

За точна диагноза се нуждаете от висококачествена ДНК проба, която е трудно да се получи от една клетка..

Грешките в PCR анализа могат да доведат до прехвърляне на ембриони с лошо качество при 11% при автозомно доминантна патология и при 2% в рецесивен.

Полимеразната верижна реакция ви позволява да определите диагнозата, ако има такава:

Дефекти на единичен ген при автозомна болест;
Патология на единичния ген при мъжкото безплодие;
Идентификация на половете при Х-свързани заболявания.

Флуоресцентна хибридизация (FISH)

FISH се използва за определяне на пола при Х-свързани заболявания, хромозомни аномалии и анеуплоидия..

Сонди, които представляват малки фрагменти от ДНК, съответстващи на анализираните хромозоми, се свързват с "тяхната" хромозома. Всяка сонда има своя собствена боя. Процесът се визуализира под флуоресцентен микроскоп. Броят на хромозомите на всеки цвят се отчита и се правят заключения..

Флуоресцентната in situ хибридизация е оправдана, ако е необходимо да се извърши:

Анеуплоиден скрининг при жени на възраст над 38-39 години;
Преброяване на броя на хромозомите при мъжкото безплодие;
Идентификация на половете при заболявания, свързани с Х;
Диагностика на родителските транслокации, които са довели до многократни аборти.

Сравнителна геномна хибридизация (CGH, SHG)

Човешката клетка съдържа 23 двойки хромозоми; Въпреки това, FISH анализът позволява точна оценка на само 7–9 хромозоми във всяка получена клетка. Следователно, много анормални ембриони остават неоткрити и могат да бъдат използвани при прехвърлянето.

При провеждане на сравнителна геномна хибридизация, тестовата ДНК се третира с флуоресцентно багрило (зелено), а червеното се използва за пробата. След това две клетки се хибридизират и се сравнява съотношението между двата цвята. Ако хромозомният анализ показва излишък на червено, ембрионалното ядро съдържа допълнителна хромозома. Ако има излишък на зелен цвят, тогава един от хромозомите липсва в ембрионалното ядро.. SHS позволява не само да се оценят всичките 23 хромозоми, но също така дава по-подробна картина на дължината, която може да открие дисбаланс на хромозомните сегменти..

Понастоящем този метод отнема 72 часа. Предвид ограничената продължителност на живота на ембрионите в хранителната среда, е необходимо витрифициране на ембрионите. Дори при висока преживяемост криоконсервацията може да доведе до 30% загуба на жизнеспособни ембриони..

Обърнете внимание

В големите репродуктивни клиники те вече работят по ускорени протоколи SHG, където резултатът става известен след 24 часа, което позволява да не пропуснете оптималното време за трансфер..

Тестване на NGS

Методът включва определяне на последователността на нуклеотидите (основните структури на наследствения материал) в РНК и ДНК.

Ползите включват:

способността да се оцени полезността / дефектите на всички хромозоми;
минимизиране на грешки, дължащи се на автоматизация на процесите;
едновременно декодиране на множество последователности;
повторен анализ на локуса на генетичния код;
висока чувствителност и точност;
минимизиране на погрешното заключение (0.001%);
атравматично за ембриона;
увеличаване на шансовете за успешно ин витро оплождане.

Абсолютни индикации за NGS: пренасяне на хромозомни аномалии при родители или в рода, генетични заболявания, свързани с пола \ t.

Проучване преди имплантация NGS включва следните стъпки:

биопсия на ембриона в стадия на бластоциста, по-често биопсия на трофоекодермата;
изолиране на молекули на нуклеинова киселина;
създаване на база за последващо генетично тестване,
амплификация за получаване на ампликони чрез PCR метод, които са взети като проба;
компютъризирана визуализация на първичен ДНК / РНК модел в резултат на многостранен непаралелен фрагментационен анализ.

Специалистът оценява на компютърната графика, която показва патологията под формата на спадове или върхове.

Въз основа на NGS тестове, ембрионите с ниска жизненост или с клинично изразени мутации се отхвърлят, а останалите след размразяването се използват в IVF протоколи..

Не всички репродуктивни клиники провеждат този анализ..

Важно е

Предварителната имплантационна диагноза не е включена в списъка на услугите за задължително здравно осигуряване и се заплаща от пациента.

Какво се изследва с PGD

Повечето клиники извършват биопсия на ембрионите на етапа на разцепване, но един от 3 метода може да се използва за PGD.

Биопсия на полярното тяло

Методът е подходящ за откриване на генетична патология при една жена, тъй като се оценява броят на хромозомите в яйцеклетката. Биопсията на полярното тяло не позволява да се получи информация за хромозомната структура на бъдещия ембрион, тъй като тя ще получи втората половина от генетичния материал от бащата. Този метод се използва рядко..

Биопсия на ембриони с хетинг

Най-честият метод на PGD е изследването на единичен бластомер, получен от развиващ се ембрион на третия ден. Приемането на бластомер е технически трудна процедура, която се извършва с помощта на специален микроскоп и микроманипулатори. Целта - премахването на желаните клетки с минимална травма на ембриона.

На третия ден от развитието, ембрионът се състои от 6-10 клетки и преди манипулиране се съхранява в специална среда за 20 минути, за да се намали залепването на бластомерите. След това ембрионът е фиксиран и в зоната pellucida се създава дупка, която отваря достъп до бластомерите. Тази процедура се нарича "излюпване" и може да се извърши с помощта на киселинен разтвор, лазер или механично. В дупката се поставя пипета, която се фокусира върху избрания бластомер с видимо ядро. Чрез аспирация бластомерът се екстрахира и обработва за FISH, или за PCR (PCR диагностика), в зависимост от генетичната патология. Ембрионът се потапя в подходяща хранителна среда..

Недостатъците на метода включват факта, че ембрионът може да бъде мозайка, а за генетичен анализ съществува вероятност за премахване на "здравия" бластомер..

Биопсия на бластоцисти

Образуването на бластоциста започва на 5-ия ден и се определя от натрупването на вътрешна и външна клетъчна маса. На този етап ембрионът се състои от около 100 клетки. Чрез дупката клетките се вземат от трофоекодермата с помощта на тънка пипета за биопсия. Вътрешната клетъчна маса не е наранена. Генетичният анализ се извършва, като се използва FISH или PCR.

Ограничаване на диагностичната процедура - ембрионална мозайка и необходимото време за изследването - 24-48 часа, което значително намалява жизнеспособността и нарушава имплантацията.

Единственият изход е да се замрази биоматериалът, след което качеството на ембрионите страда леко.

PGD в повечето случаи приключва в рамките на 24 часа след извършване на биопсия, което ви позволява да извършите трансфера на ден 4 или 5.

Обърнете внимание

Повечето клиники анализират 24 хромозоми (22 автозоми и 2 сексуални хромозоми), като използват сравнителна геномна хибридизация при ембриони, достигащи 5-дневна възраст..

Плюсове и минуси на генетичния анализ в 3-дневни и 5-дневни ембриони

Три дни:

по-голям риск от нараняване (около 15%, важна роля играе квалификацията на ембриолога);
способност за извършване на анализ само на 9 хромозоми, включително само най-честите наследствени заболявания;
вероятността за биохимичен и пропуснат аборт поради патология при неизследвани хромозоми;
мозаицизъм.

Пет дни:

жизнеспособността на ембрионите намалява, тъй като те съществуват извън тялото на майката, има нужда да се изчака биопсията да се осъществи (възможно е ранният бластоцист да се подложи на витрификация или трансфер);
спиране на развитието на "добри" ембриони, които не са свързани с генетични фактори;
възможността за провеждане на цялостен хромозомен анализ;
нисък риск от увреждане на ембриона (около 5%).

Важно е

Ембрионите с лошо качество се отхвърлят, ако прехвърлянето им е станало, бременността или не е настъпила, нито е завършила с развитие или самопрекъсване в ранните етапи..

Какъв е най-добрият начин за PGD

Експертите смятат, че сравнителната геномна хибридизация е по-добра от

FISH-диагностика, тъй като възможностите на метода са по-широки, а рискът от нараняване на ембриона е по-малък. С особеностите на кариотипа на родителя (например, транслокация) съществува възможност за присъединяване на интерхромозомния ефект - риск от неправилна дивергенция на всички хромозоми, а не само на тези, които са повредени и диагностицирани по време на кариотипирането при майката или бащата..

Недостатъците включват нуждата от криоконсервация и висока цена.

FISH изследването е за предпочитане пред PCR, тъй като полимеразната реакция носи риск от погрешна диагноза поради биологично замърсяване..

Днес най-ефективният метод - NGS - последователност от ново поколение.

Мишина Виктория, уролог, медицински рецензент